在白天，羽丘芽美（樱井智 配音）是就读于圣波利亚学院二年级的普通女生，可是一到夜晚，她就会变身成为行侠仗义的怪盗圣少女，在好友深森圣良（井上喜久子 配音）的帮助下展开劫富济贫的行动。芽美最大的对手不是别人，正是同班同学，自称为名侦探的飞鸟二世（冈野浩介 配音）。飞鸟强烈的正义感让他下定决心，誓要揭开圣少女的真正面目，父亲刑警的职业也为飞鸟的抓捕行动提供了便利，虽然屡屡经历失败，但飞鸟并没有因此而气馁。

幕末时期，维新派在传奇的刽子手拔刀斋绯村剑心（凉风真世 配音）引退后，选出同样具有高超剑术的志志雄真实（池田政典 配音）继续着暗杀任务。在维新即将获得胜利之际，为掩盖种种不可告人的秘密，新政府密谋杀害志志雄。谁知全身遭到重度烧伤的志志雄却从地狱活转，怀着巨大的仇恨制定了“京都破坏计划”，他的手下网罗了四乃森苍紫、濑田宗次郎、宇水、张等一大批高手。与此同时，剑心、京都御庭番众、斋藤、比谷清十郎纷纷行动起来，朝向京都进发。一场决定历史命运的大战即将拉开序幕…… 本片根据和月伸宏的同名漫画改编。